Особенности клонирования днк по типу in vivo
После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить, т.е. клонировать. Цель: получить многочисленные копии желаемых генов. Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды или фаговые ДНК, для крупных – космиды и искусственные хромосомы.
Существует два подхода к клонированию ДНК:
использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК.
амплификация ДНК in vitro.
Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (библиотека кДНК).
Геномная библиотека (банк генов, клонотека) – это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Для создания банка генов необходимо:
выделение всей геномной ДНК
фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком
Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК
рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.
Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.
Недостаток: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Достоинство: библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.
Использование:
-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков
-сохранение генофонда исчезающих видов
Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.
Библиотека кДНК.
Это копии ДНК, комплементарные РНК. Т. к. кДНК получают из зрелых мРНК, прошедших процессинг, они не содержат интронов.
Библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых она была выделена.
Для создания бибиотеки кДНК необходимо:
-выделить мРНК (у эукариот только мРНК содержит поли-А хвосты)
- in vitro к мРНК добавляют короткую цепь dT и проводят отжиг
- на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется комплементарная нить ДНК
- в щелочной среде цепь РНК расщепляется на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Достоинства: кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.
Недостатки: гены эукариот содержат интроны, которые удаляются из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если необходимо получить белок путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.
Чтобы клонировать ДНК in vivo, создают банк генов (библиотеку ДНК), т. е. коллекцию клонов ДНК, включающих все фрагменты генома данного вида. Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).
Геномная библиотека. Первую геномную библиотеку создал Т. Маниатис с сотрудниками в 1978 г. Они использовали ДНК из генома D. melanogaster, которую клонировали в клетках Е. coli. Для создания банка генов выделяют всю геномную ДНК, разрезают ее с помощью рестриктаз или методом «дробовика» (ультразвуком) на отдельные фрагменты, присоединяют к плазмидным или вирусным векторам и вводят в реципиентные бактерии для их последующего клонирования.
Многие плазмиды-вектора несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то трансформированные клетки (колонии) легко выявлять, выращивая их на среде с антибиотиком. Каждая такая колония представляет собой клон, или потомство, одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид, несущих разные участки генома, можно назвать библиотекой геномной ДНК. В таком виде банк можно сохранить.
Недостаток геномных библиотек в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержит полноразмерные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интрон- ные последовательности.
Библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго. В ней содержится вся наследственная информация организма. Банк генов — это не только источник для получения нужного трансгена, но и источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функций белков. С его помощью можно также решить проблему сохранения генофонда исчезающих видов.
Клоповая библиотека генов (кДНК). Помимо геномных, существуют библиотеки кДНК — молекул ДНК, которые являются комплементарными копиями зрелых мРНК, прошедших процессинг; они не содержат интронов. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимера- зы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с «тупыми» концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Существенные преимущества библиотеки кДНК заключаются в том, что она представляет собой библиотеку транскрибируемых генов, которая ничем не прерывается, тогда как в геномной библиотеке не обязательно присутствуют только дискретные гены (рестриктазы могут разрезать ДНК и внутри гена).
Кроме того, гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную. Этот процесс называется сплайсингом (созревание — удаление последовательностей, не кодирующих белковые продукты). После чего следует сращивание. Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуется цель получения белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК. Библиотека к ДНК отражает спектр генетической активности в клетках, из которых она была выделена. Создание таких библиотек полезно для сравнения генетической активности в клетках разных тканей.
Поиск нужных генов в геномной библиотеке. Одним из методов поиска нужных генов в банке является гибридизация, включающая блоттинг (от англ, blotting — промокание). Блоттинг — это метод перенесения фрагментов нуклеиновых кислот на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) эти молекулы.
Саузерн-блоттинг (назван по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.
Анализ проводят в такой последовательности:
- — выделенную ДНК разделяют в агарозном геле, где происходит электрофоретическое разделение ее фрагментов по массе и заряду;
- — после разделения фрагментов ДНК в агарозном геле его обрабатывают растворами, денатурирующими ДНК (происходит образование одноцепочечных ДНК). Далее гель помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором;
- — на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, на который происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК;
- — поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т. е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой;
- — фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 °С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле;
- — ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК-зондом, в котором происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде темных полос на рентгеновской пленке, т. е. на радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра.
Для анализа РНК применяют Нозерн-блот-гибридизацию, во многом похожую на Саузерн-блоттинг. В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда. В этом методе в качестве зонда обычно используют фрагменты ДНК.
После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить.
Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.
Клонирование ДНК in vivo
Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).
Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).
Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.
Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.
После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить, т.е. клонировать. Цель: получить многочисленные копии желаемых генов. Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды или фаговые ДНК, для крупных – космиды и искусственные хромосомы.
Существует два подхода к клонированию ДНК:
1) использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК.
2) амплификация ДНК in vitro.
Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (библиотека кДНК).
Геномная библиотека (банк генов, клонотека)– это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.
Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.
Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Для создания банка генов необходимо:
1) выделение всей геномной ДНК
2) фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком
3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК
4) рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.
5) Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.
Недостаток: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.
Достоинство:библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.
Использование:
-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков
-сохранение генофонда исчезающих видов
Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.
Читайте также: