In vivo и in vitro что это такое
В статье рассмотрено – эффективное планирование и варианты проведения экспериментальных исследований с привлечением оптимального спектра методов для установления возможных направлений действия фармакологических веществ in vitro, ex vivo, in vivo. Конечной целью комплексного использования батареи методов является получение достоверных и достаточных по объему экспериментальных данных, сокращение объемов, стоимости и сроков исследования за счет грамотной разработки дизайна исследования и использования данных, полученных на каждом этапе.
Ключевые слова: скрининг, доклинические исследования, лекарственные средства, фармакологическое вещество, эффективность, безопасность, in vitro, ex vivo, in vivo.
SeleznevaA.I. 1 , KalatanovaA.V. 2 , AfonkinaO.V. 3
COMPLEX APPROACH TO STUDY PHARMACOLOGICAL AGENTS IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO
Abstract
The article considers effective planning and options for experimental studies involving the optimum range of methods to identify possible areas of action of pharmacological agents in vitro, ex vivo, in vivo. The ultimate goal of the integrated use of a battery of methods to provide a reliable and sufficient in terms of experimental data, reducing the volume, cost and timing of the study by a competent study design and the use of data collected at each stage.
Keywords: screening, pre-clinical studies, drugs, pharmacological agent, the efficiency, safety, in vitro, ex vivo, in vivo.
Успешное изучение эффективности и безопасности фармакологических веществ напрямую зависит от грамотного планирования и разработки дизайна исследования. Существует большое количество методов как скрининговой, так и объемной оценки возможной направленности действия и токсических свойств фармакологических веществ. Эти методы можно условно определить в три группы согласно способам их выполнения – методы in vitro, ex vivo, in vivo.
Методы in vitro подразумевают скрининговую или объемную оценку эффективности и безопасности фармакологических веществ в модельных системах с использованием реакционных сред, ферментов, клеточных линий и др. На сегодняшний день в мировом научном сообществе методы in vitro очень популярны, как с точки зрения высокой инновационности, так и с позиции гуманного обращения с животными. Однако ограничение исследований эффективности и безопасности фармакологических веществ методами in vitro не целесообразно, так как экстраполяция полученных результатов на целый организм характеризуется высоким риском.
Методы ex vivo представляют собой, как правило, изолированные органы и ткани живых организмов. Эти методы также широко известны, а данные, полученные в результате исследований ex vivo, как правило, характеризуются большей релевантностью клинике. Однако, также как и методы in vitro, результаты исследований ex vivo, не могут являться основанием для начала клинических испытаний фармакологического вещества.
Методы in vivo являются классическими для экспериментальной фармакологии и представляют собой исследования на различных видах и линиях животных. Методы in vivo позволяют получить достоверные и достаточные по объему результаты, которые могут быть с успехом экстраполированы в клинику. Существует большое количество данных об анатомических, физиологических, биохимических и других особенностях видов и линий экспериментальных животных, которые позволяют установить степень релевантности человеку и прогнозировать результаты клинических исследований фармакологических веществ. Однако, не смотря на высокую информативность исследований in vivo, наиболее успешный подход к разработке дизайна исследований может быть обеспечен результатами исследований in vitro и ex vivo. Эти методы также позволяют существенно сократить количество животных в эксперименте, что имеет ключевое значение с точки зрения биоэтики [1,2].
В данной работе определены возможные варианты комплексной оценки эффективности фармакологических веществ с применением батареи методов in vitro, ex vivo и in vivo. Использование комплексного подхода позволяет сделать экспериментальное исследование максимально информативным и достоверным.
Комплексная оценка эффективности фармакологических веществ in vitro, ex vivo и in vivo
Для исследования эффективности фармакологических веществ особенное значение имеет скрининг фармакологической активности, пилотные исследования и изучение механизмов действия. Так, новые фармакологические вещества могут быть синтезированы или получены из природного сырья с использованием различных методов, может быть выделено большое количество стереоизомеров или веществ, отличающихся по структуре на одну или несколько функциональных групп. Проведение полноценного исследования каждого из кандидатов требует больших временных, экономических затрат и использования большого количества животных. Применение методов in vitro и ex vivo в большинстве случаев позволяет выбрать наиболее перспективные кандидаты и сократить объем исследований [3].
Исследование in vivo позволяет получить объемные данные, оптимальные для экстраполяции в клинику. Применение различных моделей заболеваний на животных, а также использование генетически модифицированных видов способствует установлению механизмов фармакологического действия, эффективных доз, динамики значений маркеров патологии при длительном курсовом применении и др.
В качестве примера приведем комплексное исследование эффективности фармакологического вещества Х, потенциально обладающего антиоксидантными и кардиопротективными свойствами, в системе методов in vitro, ex vivo и in vivo.
Дизайн исследования представлен в таблице 1.
На первом этапе исследования механизмов действия in vitro было установлено, что фармакологическое вещество Х характеризуется выраженной эффективностью в отношении гидроксильного радикала и перекисного окисления липидов (табл. 2).
Эффективность фармакологического вещества Х превышала таковую препарата сравнения Y.
Установлено, что наличие антиоксидантных свойств фармакологического вещества обусловливает его цитопротекторные свойства [4]. В многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях определено, что оксидативный стресс играет ключевую роль в развитии кардиоваскулярных патологий, таких как ИБС, АГ, атеросклероз, коронарная недостаточность и сердечная недостаточность [5,6].
Результаты исследований in vitro позволили определить основные направления экспериментального дизайна ex vivo и in vivo, а также установить возможные механизмы действия фармакологического вещества.
Вторым этапом исследований было определение кардиопротекторных свойств фармакологического вещества Х в эксперименте ex vivo, проведенном на изолированном сердце по методу Лангендорфа [7]. Исследование проводили при применении фармакологического вещества Х в трех дозах.
В результате второго этапа исследований было установлено, что значения показателей давления (LVP) и скорости сокращения (dP/dt max) левого желудочка на фоне ишемии с последующей реперфузией изолированного сердца статистически значимо увеличиваются, что может свидетельствовать о положительном инотропном действии препарата (рис. 1).
Рис. 1 – Эффективность фармакологического вещества Х в исследовании ex vivo.
Данные, полученные в исследовании in vitro и ex vivo, дают основание предполагать ключевой механизм действия и фармакологический эффект вещества, а, следовательно, планировать эксперименты in vivo.
Таким образом, так как in vitro и ex vivo фармакологическое вещество X характеризовалось выраженной кардиопротекторной активностью, а также влиянием на антиоксидантную систему, то для изучения специфической активности in vivo были выбраны модели сердечно-сосудистых патологий, патогенез которых связан с оксидативным стрессом и нарушением сократимости миокарда: острый инфаркт миокарда и артериальная гипертензия.
В результате исследований эффективности фармакологического вещества Х in vivo на модели острого инфаркта миокарда было установлено влияние на физиологические и биохимические параметры моделируемой патологии (табл. 3).
В результате исследований эффективности фармакологического вещества Х in vivo у спонтанно-гипертензивных крыс наблюдали выраженное снижение систолического (САД) и диастолического (ДАД) артериального давления как до применения фармакологического вещества Х, так и через 1 час после (табл. 4).
Таким образом, в результате использования комплексной оценки in vitro, ex vivo и in vivo была установлена высокая эффективность нового фармакологического вещества Х и определены возможные механизмы действия. На модели изолированного сердца по методу Лангендорфа и при моделировании острого экспериментального инфаркта миокарда in vivo было установлено кардиотоническое и кардиопротективное действие препарата. При применении нового препарата у спонтанно-гипертензивных животных наблюдалось стойкое снижение АД, а также уменьшение цифр исходного давления к концу курса лечения. Было установлено, что ключевую роль в реализации фармакологических эффектов фармакологического вещества Х играет его антиоксидантная активность, что было подтверждено в исследованиях антирадикальной и восстанавливающей способности in vitro.
Использование методов in vitro и ex vivo позволило существенно сократить объем экспериментальных животных, так как на основании их результатов были выбраны эффективные дозы фармакологического вещества Х и наиболее подходящие экспериментальные модели.
Для того, чтобы запустить в массовое производство различные препараты – косметические, лекарственные или БАДы, они должны пройти ряд испытаний, которые подтвердят эффективность и безопасность этих средств. Тогда и проводится серия экспериментов с приставкой in vitro и in vivo. Слова во многом похожи, однако между ними есть очень большая разница. Они обозначают совершенно разные виды испытаний. Разберемся с этими понятиями на примере косметических средств и испытаний лекарств, вакцин.
Исследования in vitro и in vivo, а также некоторые другие, проводятся в отношении эффективности косметических продуктов для жирной или сухой кожи, увлажнения, старения кожи, пигментации, роста волос и т. д. Также они изучают безопасность и эффективность определенных лекарств или добавок.
В чем разница между методами тестирования in vitro и in vivo
Современная наука предлагает множество методов проверки безопасности и эффективности косметических и лекарственных средств. Некоторые из обычно используемых методов тестирования косметики включают in vitro и in vivo. Хотя оба типа экспериментов проводятся вне живого организма, между ними есть важные различия.
В дословном переводе латинский термин «in vitro» означает как исследования «в стекле». Другими словами – это исследования в пробирках, в условиях экспериментальной научной лаборатории. Обычно эти эксперименты проводят в так называемой контролируемой среде – это пробирки с определенными растворами или чашках Петри (плоские круглые стеклянные баночки с крышками).
Термин «in vivo» в дословном переводе будет обозначать «внутри живого». То есть, это исследования на живых организмах, например, насекомых, животных или людях.
Эти эксперименты обычно проводятся в рамках клинических исследований, испытаний новых препаратов, косметических компонентов, биодобавок и различных возбудителей инфекций (вирусы, грибки или бактерии), вакцин или сывороток против них. Научные эксперименты «в пробирках» и на живых объектах необходимы для расширения объема знаний о различных заболеваниях, методах их лечения, работе организма, влиянии на него тех или иных составов. Также эти виды экспериментов применяются для новых научных открытий, проверки теоретических гипотез на практике. Использовать могут как один из методов, так и оба сразу.
Иногда их дополняют и другие методы – например, методика «ex vivo» - изучение тех или иных веществ на живых тканях, но вне тела человека или животного.
Исследования in silico - это выражение, которое означает «выполняется на компьютере или с помощью компьютерного моделирования». Выражение in silico впервые было использовано для характеристики биологических экспериментов, полностью выполняемых на компьютере. Хотя исследования in silico представляют собой относительно новое направление, его начали широко использовать в исследованиях, которые предсказывают, как лекарства взаимодействуют с организмом и с патогенами.
Что такое методы тестирования in vitro и ex vivo
Сегодня косметическим брендам доступно множество методов тестирования, которые хотят проверить свои продукты на безопасность, охарактеризовать их эффективность и активные ингредиенты, начать исследования и разработку новых рецептур.
In vitro включает эксперименты с биологическим веществом (клетками или тканями) вне живого организма. Эксперименты in vitro действительно проводятся в стекле – на чашке Петри или внутри пробирки, хотя сегодня им на смену приходят и современные пробирки из пластика или иных материалов.
Одна из особенностей тестирования in vitro заключается в том, что определенная линия клеток (например, кератиноциты, фибробласты или меланоциты – все это клетки кожи) выделяется, отделяется и очищается от их обычного биологического окружения. Это позволяет проводить более подробный клеточный и молекулярный анализ и оценку реакций клеток по сравнению с использованием в рамках всего организма. Кроме того, изолированные клетки, как правило, при правильных условиях можно подращивать и делить, чтобы получить запас и партии для будущего повторного использования.
Эксперименты in vitro можно проводить на широком круге подопытных объектов, от бактерий и вирусов до клеток, полученных из живых организмов. Благодаря современной науке, сейчас доступны все более сложные модели in vitro.
Исследования ex vivo означают «вне живого тела». В этом типе экспериментов живые ткани создаются не искусственно, а берутся непосредственно из живого организма. Затем эксперимент сразу же проводится в лабораторных условиях с минимальным изменением естественных условий организма. Это могут быть клетки кожи ,сальных желез, волос или ногтей, нервные, мышечные или любые другие элементы.
Тестирование косметики и лекарств in vitro и ex vivo
Исследования in vivo
In vivo относится к экспериментам с использованием всего живого организма, в отличие от отдельных клеток в пробирке или изучения мертвого организма. Исследования на животных и клинические испытания на людях – это две формы исследований in vivo. Тестирование in vivo часто используется вместо тестирования in vitro, поскольку оно лучше подходит для наблюдения за общими эффектами эксперимента на живом субъекте. Хотя есть много причин полагать, что исследования in vivo могут предложить убедительные сведения о природе биологических процессов и болезни, существует ряд причин, по которым эти выводы могут вводить в заблуждение. Например, терапия может принести краткосрочную пользу, но причинить долгосрочный вред.Сходство in vivo и in vitro
Прежде всего, есть одно существенное сходство между in vivo и in vitro: это их цель. Как и во всех медицинских исследованиях, независимо от того, проводятся ли они in vitro или in vivo, цель всегда одна: лучше понять определенное заболевание и способы его лечения, а также расширить знания о различных функциях тела. Тем не менее, в этих исследованиях есть много различий, и зачастую эксперименты в лаборатории проводятся первыми, для того, чтобы убедиться в безопасности методики. Только после этого уже переходят к исследованиям на животных, а потом – на людях-добровольцах.
Кремний (Si), химический элемент IV группы периодической системы Менделеева; атомный номер 14, атомная масса 28,086. Кремний — полупроводник, нашедший широкое применение в электронике для изготовления элементов полупроводниковых схем (от простейших транзисторов до сверхбыстрых современных процессоров).
Автор
Редакторы
Статья является введением к теме «Сухая биология» — в ней раскрывается смысл понятия in silico, а так же обсуждается его взаимосвязь с такими устоявшимися терминами как in vivo и in vitro.
Открывая этот новый раздел, хочется сказать несколько вводных слов, так как у большинства читателей наверняка может возникнуть вопрос: «что такое „in silico“?».
За последние несколько десятилетий развитие компьютерной техники достигло небывалых размахов. И как следствие компьютеризация захватила многие отрасли науки и техники. Биология также не является исключением. Если раньше компьютер рассматривался лишь как средство обработки экспериментальных данных, характер которых мог быть чрезвычайно разнообразным, от статистических исследований численности популяций, до обработки данных рентгеноструктурного анализа, то со временем стала развиваться идея полностью компьютерного эксперимента. Теперь компьютер стал рассматриваться как среда проведения эксперимента, т.е. имея на входе определенные исходные параметры, мы можем получить некие результаты моделирования, описывающие поведение исследуемой нами системы. Для обозначения всего, что связано с компьютерными экспериментами, в 90-е годы XX века даже возник полушутливый латинизм — in silico (от in silicon, т.е. «в кремнии» — подробнее см. 1–2), который дополнил ряд уже имеющихся еще с конца позапрошлого столетия классических определения характера экспериментальной среды — in vivo («вживую» — т.е. непосредственно в биологической системе), in vitro («в стекле», то есть в среде искусственно созданной — в пробирке), см. рис. 1. Термины in vivo и in vitro хорошо прижились среди экспериментаторов, однако смысл их использования достаточно относителен. Так, под in vivo молекулярный биолог, изучающий аспекты синтеза белка, может подразумевать колонию искусственно выращенных клеток, а под in vitro — систему бесклеточного синтеза в пробирке. При этом, для физиолога, изучающего механизмы проведения нервного импульса, in vivo — это целый организм, а in vitro — культура нервной ткани. В свою очередь, подход in silico также многоуровневый и включает в себя задачи по моделированию поведения отдельных молекул, биохимических процессов и даже функционированию отдельных физиологических систем.
Рисунок 1. Многоуровневый подход в изучении биологических систем: in vivo — т.е. в живом объекте (а), in vitro — т.е. в искусственно смоделированной среде (б), in silico — т.е. в полностью смоделированной на компьютере биологической системе (в).
Учитывая тематику нашего сайта, в разделе «Сухая биология» мы будем помещать материалы, в основном посвященные современным методам молекулярного моделирования. Молекулярное моделирование — это один из аспектов понятия in silico, который представляет из себя набор вычислительных методов, позволяющих с разной степенью физичности на атомарном уровне изучать молекулярные системы разной сложности. Методы молекулярного моделирования можно разбить на определенные группы, которые объединяют различные подходы, позволяющие решать задачи разного характера. К первой такой группе можно отнести все методики анализа биологических текстов (аминокислотных и нуклеотидных последовательностей), а также работу с соответствующими базами данных — ныне эта область получила специальное определение — биоинформатика. Следующая группа методов объединяет методики изучения эволюции молекулярных систем с использование эмпирических силовых полей. Набор подходов, позволяющих определять пространственную структуру белковых молекул, учитывая имеющиеся структурные шаблоны белков с гомологичными аминокислотными последовательностями, получил название моделирование на основании гомологии. Наконец, специальные подходы, позволяющие изучать взаимодействия типа лиганд-рецептор или фермент-субстрат, относятся к области молекулярного докинга. Обо всем этом вы узнаете подробнее на страницах раздела «Сухая биология».
В медицинских статьях, описывающих те или иные исследования, часто употребляются два похожих термина – «in vitro» и «in vivo». Разберемся подробнее, что же они означают.
1 год назад , 09.09.2020
Термин «in vitro» переводится как « в стекле» и означает, что эксперименты проводятся вне живого организма. Термин «in vivo» в переводе звучит как «в жизни», соответственно, эксперимент проходит в естественных условиях. В целом же обе эти методики помогают ученым больше узнать о болезнях и разнообразных процессах, происходящих в живом организме.
In vitro
Итак, тестирование «in vitro» чаще всего происходит в условиях лаборатории и подразумевает изучение микроорганизмов, клеток животных или человека в определенной культуре. Эта методика помогает оценивать процессы, происходящие в конкретных клетках без целого ряда отвлекающих факторов, присущих живому организму.
Это довольно простая методика, и она позволяет изучать больше субъектов, чем при экспериментах с участием людей и животных. Но самый главный недостаток таких исследований, что среда в чашке петри не может быть полностью схожа со средой живого организма.
Довольно часто тестирование «in vitro» применяют в ходе фармацевтических испытаний. Новые лекарства всегда проверяются таким образом перед началом клинических испытаний с участием добровольцев.
Кроме того, метод «in vitro» лежит в основе наиболее эффективного метода лечения бесплодия – ЭКО. При экстракорпоральном оплодотворении процесс соединения двух клеток проходит не внутри организма, а в специальной среде. И только потом получившийся эмбрион подсаживают в матку женщины.
In vivo
Исследования «in vivo» также популярны в фармакологической промышленности. В целом такие тесты – крайне важный аспект медицинских исследований. Главными тестами «in vivo» являются тесты на животных и клинические испытания.
В ходе экспериментов с участием животных ученые имеют возможность выявлять процессы, лежащие в основе разных болезней и патологий. Можно сказать, что такие тесты – промежуточный этап между тестированием «in vitro» и испытаниями на людях.
Клинические испытания на людях – чаще всего завершающий этап любого крупного исследования. Обычно они применяются в фармакологии при выводе на рынок нового препарата или вакцины.
Читайте также: