Посев по айзенбергу микробиология

Обновлено: 10.01.2025

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – "зеркало". Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

• При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
• При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

• • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
• • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

• Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 "С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
• Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
• Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний" (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

• • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

• • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Один из самых точных и информативных лабораторных исследований качества мочи (урины) — бактериологический анализ мочи (бакпосев, посев на микрофлору). Этот метод диагностики выявляет патогенные микроорганизмы и определяет их чувствительность к антибактикам. Это позволяет сэкономить время и сразу назначить эффективное лечение.

Прием уролога, гинеколога — 1000 руб. Комплексное УЗИ малого таза — 1000 руб. Прием по результатам УЗИ или анализов — 500 руб (по желанию)

Недостатком анализа можно назвать особые требования к сбору материала и длительность теста. Однако лишь при посеве мочи врач получает точную уникальную информацию, которую часто не способны показать другие лабораторные исследования.

Показания для назначения бакпосева мочи

Анализ мочи на посев может быть назначен терапевтом, гинекологом , урологом или педиатром в следующих случаях:

• при инфекциях мочевыделительной системы (рецидивирующий цистит , пиелонефрит , урологические патологии, мочекаменная болезнь );
• при болезнях органов ЖКТ (энтерококк и дизентерия);
• при сахарном диабете , беременности и бесплодии , иммунодефиците, туберкулёзе, ВИЧ;
• для контроля эффективности проведённого лечения инфекции ;
• для уточнения диагноза при неоднозначной симптоматике;
• для выявления устойчивости микроорганизмов к антибактериальной терапии.

Также бакпосев мочи может назначаться при наличии следующих симптомов:

(наблюдается при цистите);
• нарушение частоты мочеиспусканий (может свидетельствовать о поражении почек, простатите );
• тошнота, рвота, общая слабость, повышение температуры (симптомы заболевания почек);
• боль в пояснице (сигнал возможного развития бактерий в почечных канальцах);
• изменение цвета мочи.

Какие патологии выявляет бактериологический анализ мочи

Бакпосев на патогенную флору поможет диагностировать такие заболевания, как:

• хронический уретрит ;
• рецидивирующий цистит;
• пиелонефрит;
• паранефрит.

Бактериологический анализ мочи выявляет следующие инфекции в зависимости от возбудителя:

• Стафилококки и стрептококки . Выявляет все виды патогенных микроорганизмов, опасных при беременности для ребёнка; . Патогенные микроорганизмы в урине подтверждают сомнительный диагноз; . Назначается пациенту, если его партнёр — носитель вируса;
• Бациллу Коха . Степень бактериурии определяет наличие туберкулёза и насколько поражены почки и мочевыводящие пути при таком заболевании;
• Протеи . Протейная инфекция вызывает воспаление почек и мочевыводящих путей, может привести к острому пиелонефриту;
• Энтерококки . Эти кишечные бактерии могут быть губительными для мочевыводящей системы;
• Синегнойную палочку. Эта бактерия является причиной циститов, уретритов и пиелонефритов;
• Коклюш . Анализ выявит болезнь даже на ранней стадии и при начальных
• симптомах;
• Клебсиеллы . Опасная бактерия, устойчивая к большинству антибиотиков. Вызывает воспалительные заболевания мочевыводящих путей и может привести к различным тяжёлым последствиям;
• Дизентерийные соединения . Способен выявить сальмонеллез и дизентерию у пациентов любого возраста.

Методика исследования мочи на инфекции

Для идентификации инфекционного возбудителя анализ урины на посев проводится по следующему алгоритму:

• Первичное исследование осадка мочевой жидкости под микроскопом (проводится не всегда).
• Первичный посев мочи на стерильность для выявления типа возбудителя.
• Накопление собранной в посеве культуры.
• Изучение особенностей выявленных бактерий.
• Окончательная идентификация возбудителя.

Для теста — посев мочи — необходим подбор определённой среды: для стафилококков – кровяной агар, стрептококков – сахарный раствор и т.д. Однако могут проводить посев и в нескольких средах (максимум 3-4).

Бактериологический анализ мочи в целом занимает 7-10 дней. Полученный результат будет содержать описание величины, формы, прозрачности, оттенка, структуры поверхности, роста колонии в высоту.

Методика определения чувствительности возбудителей к антибиотикам

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (антибиотикограмма) анализ урины на посев проводится по следующему алгоритму:

• Деление чаши Петри на несколько секторов и помещение в каждый из них полоски с антибиотиком.
• Маркировка цветом каждого участка и засев выделенной культурой.
• Помещение чаши в термостат с температурой 36,6.
• Ведение ежедневного контроля. Отсутствие роста и размножения бактерий означает, что антибиотик их подавляет, а значит подобран верно.

В противном случае возбудитель устойчив к действию данного антибиотика, и его нужно заменить.

Антибиотикограмма проводится только при обнаружении бактерий более, чем 104 КОЕ/мл. Длительность такого анализа составляет 4-5 дней. Современные экспресс-методики позволяют получить результат уже через 2 дня. В экстренных случаях, когда результат необходим для лечения тяжелобольного пациента, предварительные данные могут быть предоставлены уже спустя 4 часа.

Подготовка к процедуре и сбор мочи на посев

Для получения реальной картины состояния внутренней микрофлоры крайне важно соблюсти все требования относительно подготовки и сбора мочи:

Анализ посев мочи при беременности

В период беременности женщина ещё больше, чем обычно, уязвима для различных болезней. К ним относятся и инфекции различного генеза, включая передающиеся половым путём. К тому же, исследованиями доказано, что 45% всех смертей плода ( замирание беременности , выкидыш ) случилось из-за внутриутробного инфицирования.

Бактериологический анализ мочи во время беременности обязателен, даже при отсутствии признаков инфекции. Инфекция длительно и бессимптомно могла протекать в организме женщины и активизироваться при наступлении беременности (до 6% беременных имеют скрытую бактериурию).

Важность проведения анализа мочи на посев во время беременности подтверждается следующим:

• выявление и идентификация возбудителей инфекции;
• проведение возможного лечения с учётом срока беременности;
• предупреждение заражения плода и нанесения ему непоправимых органных изменений, несовместимых с жизнью.

Проводить бакпосев мочи нужно дважды за беременность – в 1 триместре и практически перед самыми родами (на 36 неделе). При наличии соответствующих показаний это значение может увеличиться. Врач может назначить беременной дополнительные бакпосевы мочи, если она страдает заболеваниями мочевого пузыря и почек, или при общем анализе мочи были обнаружены лейкоциты и белок.

Правила подготовки и сбора материала для беременной общие. На поздних сроках беременности плод давит на мочевой пузырь, поэтому женщине порой трудно дотерпеть до утра. Рекомендуется сходить в туалет по будильнику в 1-2 часа ночи, а затем уже утром собрать мочу для анализа.

Расшифровка результатов бакпосева мочи: норма и патология

Результат анализов выводится в КОЕ на 1 мл мочи. КОЕ (колониеобразующие единицы) – это абсолютное значение, показывающее количество клеток бактерий в 1 мл урины.

Лаборатория выдаст распечатку результатов, в которой будут указаны все виды микроорганизмов, их количество, измеренное в КОЕ/мл, и антибиотикограмма – группы препаратов, к которым чувствителен каждый вид бактерий.

Результат бакпосева не всегда однозначно положительный или отрицательный. Он имеет референсные значения, которые указывают на степень воспаления.

Менее 1000 КОЕ/мл	Норма, лечение не требуется.
1000-100000 КОЕ/мл	Требуется повторное исследование. Возможно, результат искажён из-за нарушения правил подготовки или сбора мочи.
Более 100000 КОЕ/мл	Наличие инфекции, необходимо срочно начинать лечение.

На бланке антибиотикограммы проставляются значки:

Обозначение	Уровень чувствительности к антибиотикотерапии
S	высокий
I	умеренный
R	полная резистентность (устойчивость) к антибиотикам

Где сдать анализ мочи на инфекции и сделать расшифровку бакпосева в СПБ?

Такое обследование в Санкт-Петербурге проводится в специализированной уролого — гинекологической клинике Диана. Здесь же можно пройти все виды экспертного УЗИ (стоимость 1000 руб), сдать все анализы и получить консультацию гинеколога, уролога, эндокринолога , онколога и дерматолога . Стоимость консультации любого специалиста — 1000 руб.

Читайте также:

  
• Раффлезия это покрытосеменное растение или нет
  
• У глюкозы первичный крахмал у покрытосеменных образуется в
  
• Табак голден вилл описание сорта
  
• Земляника ламбада описание сорта
  
• Новые сорта ирисов бородатых